Проблемы скрытой инфекции, вызванной вирусом гепатита В

Проблемы скрытой инфекции, вызванной вирусом гепатита В

¹Морозов И.А., ¹Ильченко Л.Ю., ¹Громова Н.И.,²Фёдоров И.Г.,

¹Гордейчук И.В., ¹Зверкова Е.А., ¹Княженцева А.К. ,  ¹Михайлов М.И.

¹ФГБУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН ²Городская клиническая больница № 12 ДЗ г. Москвы

     Гепатит В (ГВ) представляет собой важнейшую медико-социальную проблему  мирового здравоохранения. Считается, что HBV-инфекцию перенесло более половины населения Земли, при этом около 350 млн. имеют хронический гепатит В (ХГВ). Каждый год в мире регистрируется более 4 млн. случаев острого гепатита В (ОГВ) и около 1 млн. смертей в результате HBV-ассоциированной патологии печени. Около 50% хронически инфицированных лиц погибают от таких осложнений заболевания, как печеночная недостаточность, цирроз печени (ЦП) и гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) [4]. Данная проблема существует и на территории Российской Федерации (РФ), имеющей регионы, эндемичные по HBV-инфекции. Высокий уровень заболеваемости, частая хронизация инфекции, а также утрата больными трудоспособности и возможность летальных исходов влекут за собой огромный демографический и экономический ущерб для государства.

     До недавнего времени считалось, что клинически HBV-инфекция может протекать в одной из трех форм: острый гепатит (ОГВ), характеризующийся симптомами острого поражения печени и интоксикации (с желтухой или без нее); ХГВ, характеризующийся длительным воспалительным поражением печени, и длительное персистирование поверхностного антигена HBV (HBsAg) в сыворотке крови пациентов при отсутствии клинически выраженного гепатита.

     Однако, еще в 1978 г. был зарегистрирован случай развития острого ГВ у реципиента после переливания крови, содержащей антитела к капсидному белку HBV (anti-НВс) в отсутствие HBsAg и антител к нему (anti-HBs). В дальнейшем было показано, что ДНК вируса может определяться в сыворотке крови и ткани печени пациентов, у которых доступными методами не выявлялся сывороточный HВsAg. Данное явление получило название «скрытая (латентная) HBV-инфекция».

     Следует отметить, что HBsAg по-прежнему является основным, а порой единственным сывороточным маркером HBV, определяемым у доноров крови.  Так, в РФ в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 3.1.1.2341– 08 для исключения HBV-инфекции у доноров крови используется только определение HBsAg. В силу этого скрытая HBV-инфекция является серьезной проблемой для центров гемотрансфузии тех стран, в которых помимо отмытых форменных элементов крови для переливания реципиентам используют плазму или даже цельную кровь, поскольку переливание крови  от людей со скрытой HBV-инфекцией может приводить к развитию у реципиента остро манифестирующего гепатита В или его хронической формы.

     В 2008 году на конференции, организованной Европейской ассоциацией изучения печени, понятие «скрытая HBV-инфекция» было определено как «присутствие ДНК HBV в печени пациентов (вне зависимости от наличия ДНК HBV в сыворотке крови), в сыворотке крови которых доступными методами не определяется HBsAg» [11]. Само определение скрытой HBV-инфекции свидетельствует о том, что диагностический поиск, ограниченный исследованием HBsAg, окажется неэффективным, а инфицированные лица пополнят группу пациентов с гепатитом неустановленной этиологии.

     Распространенность скрытой HBV-инфекции, по данным различных публикаций, варьирует в разных исследуемых группах [1,10]. Её встречаемость составляет от 0% до 2,4% среди HBsAg-негативных, anti-HBc-позитивных (но anti-HBs +/-) доноров крови в западных странах (как например, в США, где лишь 5% населения в течение жизни встречались с HBV), до 6% - в схожих группах доноров, проживающих на эндемичных территориях, где с HBV встречались 70-90% населения [7]. Однако большинством исследователей по всему миру было отмечено, что скрытая (латентная) HBV-инфекция встречается в среднем у 20% больных ХГВ и зависит от эндемичности региона [11].

     Другим важным фактором, диктующим необходимость углубленного исследования скрытой ВГВ-инфекции, является возможность ее присутствия при коинфекции другими вирусами. Известно, что коинфекция HBV у пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС) может в значительной мере сказываться на течении заболевания, уровне вирусной нагрузки, а также эффективности лечения. Отсутствие информации об особенностях течения ХГС при коинфекции HBV, протекающей в скрытой форме, не позволяет разработать рекомендации диагностики и ведения таких пациентов. Не исключено, что коинфекция другими, даже не гепатотропными вирусами, также может отражаться не только на клинических проявлениях заболевания, но и патогенетических механизмах развития патологии.

     Цель исследования: с помощью современных молекулярно-биологических и морфологических методов определить частоту встречаемости скрытой формы хронического гепатита В среди HBsAg-негативных пациентов с хроническими заболеваниями печени различной этиологии и дать ее клинико-морфологическую характеристику.

Материал и методы

     Обследовано 168 пациентов (94 мужчины и 74 женщины в возрасте от 16 до 82 лет). Из 60 больных с наличием антител HBcAg были отобраны 35 пациентов не имевших HBsAg и ДНК HBV в сыворотке крови, которым была произведена тонкоигольная чрезкожная биопсия печени. Забор крови и биоптатов печени проводился при наличии подписанного пациентами инфор­мированного согласия.

В сыворотке крови HBsAg определяли тест-системой с чувствительностью 0,01 нг HBsAg на 1 мл исследуемого образца (ДС ИФА HBsAg 0,01 производства НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород). Анти-HBc определяли тест-системой ДС АНТИ-HBc того же производителя. Детекция ДНК HBV в сыворотках крови и биоптатах печени проводилась методом двухступенчатой ПЦР с праймерами, перекрывающими Core, S и P регионы молекулы ДНК этого вируса, предложенными A. Basuni и W. Carman [5].

      Биопсийный материал с соответствующей подготовкой был использован для проведения патогистологического, иммуногистохимического, электронно-микроскопического и ПЦР-исследования. Часть биоптата (2 мм) в течение 3 минут с момента проведения биопсии замораживалась при температуре  -20⁰С на период до 1 недели с последующей транспортировкой с соблюдением режима охлаждения и глубоким замораживанием при температуре -80⁰С на срок до 1 месяца. Другая часть биоптата помещалась в 4% раствор параформальдегида в буфере Хенкса, и после фиксации и обезвоживания заключалась в смесь эпоксидных смол эпон–аралдит. В дальнейшем приготовленные ультратонкие срезы после контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца изучались в электронном микроскопе JEM-100C (Jeol, Япония). Для иммуногистохимического выявления HBsAg, HBcAg и белка HCV использовали моноклональные антитела и современные системы визуализации фирмы Novocastra на парафиновых срезах по протоколам паспортов к антителам.

Результаты и обсуждение

     Для обнаружения скрытой HBV-инфекции был предложен алгоритм, состоящий из двух этапов исследований: серологического и тканевого [2,3]. Первый этап начинался с определения HBsAg в сыворотке крови и в дальнейшем касался проведения ИФА и ПЦР всех образцов сывороток HBsAg-негативных пациентов с хроническими заболеваниями печени (ХЗП).

   I.  Серологические этапы выявления скрытой ВГВ-инфекции

1. Первичное исследование на HBsAg (ИФА) (чувствительность 0,01 нг/мл)

HBsAg (+)        HBV-инфекция

HBsAg ( - )         отсутствие HBV

   2. Исследование на anti-HBc

anti-HBc ( - )       отсутствие HBV

anti-HBc (+)       предварительный диагноз «HBV-инфекция»

3. Исследование на ДНК HBV в сыворотке крови (ПЦР, чувствительность 150 и менее

копий/мл).

ДНК HBV (+)       диагноз HBV-инфекция 

ДНК HBV (-)        ?  а) перенесенный ГВ

                                  б) ложноположительный результат анти-НВс

    II.  Тканевые этапы выявления скрытой ВГВ-инфекции

     Предполагают обязательную биопсию печени и проведение патогистологического исследования активности и стадии заболевания.

     Специальные методы исследования ткани печени проводят в зависимости от возможностей и оснащенности лечебного учреждения:

•          Гистологическая окраска орсеином на HBsAg по Shikata

•          Иммуногистохимическое (ИГХ) выявление HBsAg

•          ПЦР для определения ДНК HBV в ткани печени

•          Электронно-микроскопическое (ЭМ) изучение биоптата печени для выявления вирионов, их видовой принадлежности к HBV (иммуноцитохимия HBsAg) и специфических для HBV-инфекции изменений.

     Положительный результат любого из специальных методов служит основанием для окончательного диагноза «HBV-инфекция», если инфекционность вирионов доказана, либо «скрытая форма ХГВ».    

     Среди 168 пациентов с хроническими заболеваниями печени антитела к HBc были обнаружены у 60 (35,7%). При этом ни у одного из пациентов в сыворотке крови не была выявлена ДНК HBV. Из этих 60-ти больных были исключены лица с установленным диагнозом гепатита В (HBsAg+) и отобраны 35 пациентов, у которых отсутствовал HBsAg с диагнозами: ХГС (n=12), хронический алкогольный гепатит (ХАГ, n=9), неалкогольный стеатогепатит (НАСГ, n=4), смешанный гепатит (НАСГ у пациентов с хронической алкогольной интоксикацией,  n=2) и хронический гепатит неустановленной этиологии (ХГНЭ, n=6). У одного больного было подозрение на скрытый гепатит В, и у одного была диагностирована моноинфекция TTV. У большинства больных исследуемой группы клинический диагноз предполагал наличие внутриклеточной липидной инфильтрации в ткани печени. Однако лишь у 4 из 35 пациентов была обнаружена умеренная крупнокапельная инфильтрация триглицеридами, а у 4 - слабовыраженная мелкокапельная её форма. То есть у большинства обследованных больных отсутствовал один из основных патогномоничных признаков алкогольного или неалкогольного стеатогепатита, а клинический диагноз, по-видимому, ставился на основании анамнестических сведений. Из 9 случаев ХАГ лишь в двух было подтверждено наличие алкогольного компонента в ткани печени, тогда как неалкогольный стеатоз подтвердился в 3 из 6 случаев. В одном случае у больного с ХАГ наряду с HBV-инфекцией иммуногистохимически был обнаружен и  хронический гепатит С.

     С целью выявления скрытой ВГВ-инфекции было проведено иммуногистохимическое исследование биопсийного материала с положительным и отрицательным контролями. При иммуногистохимическом изучении с моноклональными антителами к HBsAg и HBcAg во всех биопсиях обнаружена положительная реакция на HВs-антиген. Вместе с тем, реакция на коровый антиген (HBcAg) в большинстве случаев у пациентов с моноинфекцией HBV была слабовыраженной, что свидетельствовало о низкой репликативной активности и хроническом, неактивном течении заболевания (Рис. 1а,б). 

       При электронномикроскопическом изучении биопсийного материала у всех больных установлено наличие вирионов HBV в цитоплазме гепатоцитов (Рис. 2а). Вирусные частицы представляют собой сферические образования умеренной электронной плотности, с фестончатыми краями и слабовыраженным гликокаликсом. Средний диаметр вирионов составил 49,281±2,637 nm, что несколько больше, чем при негативном

б

 

а

              

Рис. 1. Иммуногистохистохимия печени больного при хронической моноинфекции HBV. а) HBsAg в гепатоцитах в фазе накопления. х 200; б) Небольшое количество HBcAg при гепатите минимальной активности и слабой репликации вируса. х 400.

 

контрастировании (42 nm) уранилацетатом или фосфорно-вольфрамовой кислотой, которые перекрывают фестончатый край и гликокаликс вирионов. Вид вирионов в цитоплазме гепатоцитов напоминает «эффект рассыпанного гороха»; причем вирионы между собой не соприкасаются. Принадлежность этих вирионов к HBV подтверждается электронномикроскопической иммуноцитохимией с моноклональными антителами к HBsAg и использованием комплекса Protein A – Colloidal Gold для визуализации реакции антиген-антитело (Рис. 2б). Сам факт наличия вирионов не только подтверждает результаты иммуноцитохимической верификации скрытой HBV-инфекции, но и доказывает вирусную природу заболеваний, а также опровергает первоначальный клинический диагноз. В фазу накопления цитоплазма большинства гепатоцитов плотно заполнена HBV- вирионами. Отмечается активация лизосомального аппарата и активный фагоцитоз вирусов. В результате образуется большое количество резидуальных тел, содержащих липофусцин и миелиноподобные ламеллы. В цитоплазме и в матриксе митохондрий часто наблюдаются паракристаллические белковые образования.

 

Рис. 2. а) Множественные HBV-вирионы в цитоплазме гепатоцита больной со скрытым гепатитом В.  х 20 000; б) Продукт иммуногистохимической реакции с моноклональными антителами к HBsAg и комплексом Protein A – Colloidal Gold 15 нМ на вирионах. Препарат не контрастирован. х 50 000.

 

Большинство митохондрий имеют деэнергизованный вид с небольшим количеством крист и матриксом средней плотности. Однако среди них встречаются очень крупные, вытянутые в длину органеллы с необычно большим количеством продольно расположенных крист и просветлённым матриксом. Столь необычная гипертрофия внутренней мембраны без соответствующего усиления функции может быть результатом мутации митохондриальной ДНК (вследствие экспансии нуклеотидов вирусной ДНК) и синтезом измененных структурных белков. Вышеперечисленные изменения неспецифичны, поскольку встречаются и при других вирусных гепатитах. Вместе с тем, при моноинфекции вирусом гепатита В нами были обнаружены кольцевидные (торообразные) митохондрии с матриксом умеренной плотности (Рис. 3а,б) и большой протяженностью внутренней мембраны, которые не наблюдались при других гепатитах вирусной природы. Подобные изменения митохондрий, наряду с наличием HBV-вирионов

являются, на наш взгляд, единственными специфическими признаками хронического         

б

 

а

 

М

 

М

 

HBV

 

HCV

    

Рис. 3. Специфические для хронического гепатита В торообразные митохондрии. а) Тонкая структура митохондрий (объяснения в тексте). х 30 000; б) Множественные торообразные митохондрии в цитоплазме гепатоцита с В-вирионами и их отсутствие в гепатоците с С-вирионами при микстинфекции HBV и HCV. М - митохондрии. х 6 000.

 

течения вирусного гепатита.

     Изменения биохимических показателей ферментов воспаления у обследованных пациентов варьировали в столь широких пределах, что проведение оценки дополнительных маркеров перенесенной HBV-инфекции на течение ХЗП не представлялось возможным. Тем не менее, следует отметить, что уровень АЛТ и АСТ при коинфекции HBV с HCV был существенно выше, чем при моноинфекции вирусом гепатита В. При коинфекции уровень АЛТ варьировал в диапазоне 39-406 МЕ/л (средний – 120,85±26,7), а АСТ – 25-139 МЕ/л (средний – 88,4±12,8), тогда как при моноинфекции вирусом гепатита В уровень АЛТ в среднем составил 49,6±6,3 МЕ/л, а АСТ – 57,1±7,5 МЕ/л. 

     Изученные нами случаи скрытой HBV-моноинфекции характеризовались минимальными клинико-биохимическими и морфологическими изменениями, а также низким уровнем виремии и отсутствием в структуре HBsAg аминокислотных замен, способных повлиять на эффективность его детекции в ИФА. Присутствие только стабильно выявляемых антител IgG к HBcAg обычно рассматривается как свидетельство перенесенной инфекции с элиминацией вируса и ремиссией заболевания. У всех пациентов с антителами к HBcAg было установлено наличие вируса гепатита В в ткани печени, включая и всех больных ХГС.

     Ранее в 1999 году Cacciola и соавт. [6], было проведено сравнение распространенно­сти скрытой HBV-инфекции среди пациентов с ХГС. С этой целью обследовано 200 HBsAg-негативных пациентов с HCV-инфекцией, при этом у 100 в сыворотке крови обнаруживались anti-HBc, у остальных - отсутствовали какие-либо серологические маркеры HBV-инфекции. Однако ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови была обнаружена не только у 46 пациентов с anti-HBc (46%), но и у 20 пациентов - без anti-HBc (20%). При этом следует учитывать, что в то время методики верификации антигенов и антител были существенно менее эффективны.

     В наших исследованиях повторно определялись anti-HBc с целью исключения ложноположительных результатов. На этом основании можно утверждать, что присутствие anti-НВс в сыворотке крови свидетельствует не о перенесенной HBV-инфекции, а о  наличии В-вирионов в ткани печени, и что anti-НВс может служить эффективным, хотя и «суррогатным» маркером HBV-инфекции.

     Анализ публикаций отечественных и зарубежных исследователей показывает, что частота выявления скрытого гепатита В увеличивается с повышением чувствительности методов детекции ДНК вируса гепатита В и снижается при повышении чувствительности тест-систем для HBsAg. Отсутствие детектируемого уровня ДНК вируса В в сыворотке крови не является фактом, исключающим наличие скрытой инфекции. Даже в таких случаях вирус может находиться в ткани печени. В основе этого явления лежит сам механизм репликации этого вируса: в ядре инфицированного гепатоцита может содержаться достаточное количество копий кольцевой ковалентно замкнутой ДНК - стабильной матрицы для транскрипции вирусных белков и репликации вирионов [12].

     Отсутствие HBsAg в крови может быть вызвано рядом причин, которые могут действовать одновременно:            влиянием провоспалительных цитокинов на вирусную транскрипцию, приводящих к снижению уровня репликации и экспрессии HBsAg и ДНК HBV; формированием иммунных комплексов между HBsAg и anti-HBs, не определяемых современными методами; появлением мутаций в «а»-детерминанте S-гена, приводящих к аминокислотным заменам в главной гидрофильной петле HBsAg и невозможности обнаружения HBsAg с помощью используемых на настоящий момент методов его детекции, а также коинфекцией вирусами гепатита D, HCV, HIV, приводящей к снижению уровня репликации вируса гепатита В и синтеза HBsAg.

     По нашему мнению, последняя причина может быть наиболее значимой, поскольку частота встречаемости хронических вирусных гепатитов с коинфекцией различными гепатотропными вирусами в последнее время существенно возросла. Даже в наших исследованиях все больные с ХГС, а также больной с гепатитом, вызванным TTV были коинфицированы вирусом В. К наиболее частым коинфектам следует отнести Anelloviruses, распространенность которых приближается к 100% не только у человека, но и большинства млекопитающихся [14]. Они проявляют свойства как парентерально передаваемых вирусов, так и энтеральных и могут передаваться всеми способами, за исключением аэрозольно-капельного. Поскольку вирусы этой группы имеют многочисленные генотипы, каждый из которых имеет тропизм к определенным тканям и органам, в организме человека могут сосуществовать несколько генотипов TTV и TT-like mini virus (TTMV) и не все из них имеют отношение к патологии печени. В наших исследованиях TTMV обнаруживался в среднем у 8 из 10 больных с ХЗП в лимфоцитах, нейтрофилах и тромбоцитах крови синусоидов печени, то есть был лимфотропен. Однако в последнее время нам удалось у 6 больных с гепатитом В (2 из которых были в скрытой форме) обнаружить множество вирионов TTMV, расположенных в ядрах гепатоцитов (Рис. 4), что доказывает их гепатотропность. При этом ультраструктура таких гепатоцитов

Я

 

HBV

 

 

М

 

М

 

б

 

а

 

Рис. 4. а) Вирионы TTMV в ядре и вирионы HBV в цитоплазме гепатоцита больной скрытым гепатитом В. М – митохондрии, Я - ядро (объяснения в тексте). х 10 000;

б) Вирионы TTMV при увеличении х 30 000.

 

существенно отличалась от характерной для HBV-моноинфекции. Особенно это касалось митохондрий, которые теряли присущий им вид: они несколько увеличивались в размерах, матрикс просветлялся, а количество крист уменьшалось. Специфичная для гепатита В тороидальная форма митохондрий в этих гепатоцитах не встречалась. То есть наблюдается вполне определенное влияние коинфекта (TTMV) на структуру гепатоцита, несмотря на присутствие в цитоплазме основного патогена (HBV).

     Инфекция TTMV, как и скрытая HBV-инфекция, представляет серьезную проблему для трансфузиологии не вследствие малого размера вируса (20-22 nm), а в силу его лимфотропности и персистирования в переливаемых лимфоидных элементах крови (лимфоцитах, нейтрофилах, тромбоцитах).

     Помимо этого в литературе обсуждаются онкогенные свойства TTMV [9,13]. Не исключено, что виновниками онкогенеза при хронических вирусных гепатитах являются не сами гепатотропные вирусы В и С, а представители семейства Anelloviridae.

     Таким образом, наше исследование показало, что включение в обследование пациентов определе­ния anti-HBc в сыворотке крови меняет представление об этиологии ХЗП. Было установлено, что встречаемость скрытой формы гепатита В среди пациентов с ХЗП в гастроэнтерологическом отделении чрезвычайно высока и составляет не менее 20%. Полученные результаты согласуются с литературными данными.  Так, в недавно проведенном в Италии исследовании скрытая HBV-инфекция обнаруживалась у 16,3% из 98 пациентов без каких-либо клинических или биохимических признаков заболевания печени [15]. Castillo и соавт., 2007 г. [8], провели определение ДНК HBV и РНК HCV в ткани печени у 76 серонегативных по HBsAg пациентов со стабильным повышением уровня активности АЛТ, наблюдавшихся в течение 2 лет. В указанной группе у 22% пациентов была выявлена скрытая HBV-инфекция, у 46% - HCV-инфекция, у 32% - скрытая коинфекция обоими вирусами (т.е. у 54% пациентов в ткани печени обнаруживали ДНК HBV и РНК HCV).

     На основании полученных результатов можно заключить, что «скрытый гепатит» - одна из форм хронической HBV-инфекции, трудность установления которой во многом преувеличена и обусловлена, прежде всего, недостатками диагностических стандартов, а также методическим оснащением муниципальных лечебных учреждений.

Литература

1. Вирусные гепатиты в Российской Федерации 2009. Аналитический обзор // Под ред. Г.Г. Онищенко, А.Б. Жебруна. — СПб., НИЭМ им. Пастера.- 2009. - C. 17–41.

2. Гордейчук И. В. Выявление и клинико-морфологическая характеристика скрытой ВГВ-инфекции среди HBsAg-негативных пациентов с хроническими заболеваниями печени // ДЖИП.- 2010.-№ 17.- С. 42-49.

3. Морозов И.А., Ильченко Л.Ю., Кюрегян К.К. и др. Латентная HBV-инфекция и алгоритм ее выявления у пациентов с хроническими заболеваниями печени // В мире вирусных гепатитов. - 2011.- №1.- С. 19-26.

4.  Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). // М., ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава».- 2003. — С. 22–27.

5.  Basuni A. A., Carman W. L. HBV vaccine-escape   i variants // Methods Mol. Med. - 2004. - Vol. 95.- P. 115-124.

6.  CacciolaI., PollicinoT., SquadritoG. et al. // Occult hepatitis В virus infection in patients with chronic hepatitis С liver disease // NEJM.- 1999.- Vol. 341.- P. 22-26.

7.  Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus // J. Viral Hepat. — 1997. — Vol. 4. — P. 11–20.

8.  Castillo I., Rodriguez-lcigo E., Lypez-Alcorocho J. et al. Comparative study on the clinical and virological characteristics among patients with single occult hepatitis В virus (HBV), single occult hepatitis С virus (HCV) and occult HBV and HCV dual infection // J. Med. Virol.- 2007.- Vol. 3.- P. 236-241.

9. Hausen H., de Villiers E-M. Virus target cell conditioning model to explain some epidemiologic characteristics of childhood leukemias and lymphomas // Int. J. Cancer. - 2005.- Vol. 115. - P. 1–5.

10. Hollinger F.B.  Hepatitis B virus infection and transfusion medicine: science and the occult // Transfusion.  – 2008. – Vol. 48. – P. 1001-1026.

11.  Hollinger F.B., Sood G. Occult hepatitis В virus infection: a covert operation // J. Viral. Hepat.-2010.-Vol. 17. - P. 1-15.

12.  Jeantet D., Chemin I., Mandrand B. et al. Cloning and expression of surface antigens from occult chronic hepatitis В virus infections and their recognition by commercial detection assays // J. Med. Virol. - 2004. - Vol. 73. - P. 508-515.           

13. Moriyama M., Matsumura H., Shimizu T. et al.  Histopathologic impact of TT virus infection on the liver of type C chronic hepatitis and liver cirrhosis in Japan // J. Med. Virol.-2001.- Vol.64.- P.74-81.

14.   Ninomiya M., Takahashi M., Nishizava T. et al. Development of PCR assays with nested primers specific for differential detection of the three human anelloviruses and early acquisition of dual or triple infection during infancy// J. Clin. Microbiol. – 2008.- Vol. 46. – P. 507-514.

15. Raimondo G, Navarra G, Mondello S et al. Occult hepatitis B virus in liver tissue of individuals without hepatic disease. // J. Hepatol. - 2008.- Vol. 48.- P. 743–746.